1. Khái niệm
Tinh sạch protein là quá trình phân tách một hoặc một vài protein từ một phức hợp protein trong các tế bào, mô hoặc cơ quan. Quá trình này đóng vai trò quan trọng trong việc xác định chức năng, cấu trúc và tương tác giữa các protein mà ta quan tâm. Thông thường, người ta tinh chế protein dựa vào kích thước protein, các đặc tính lý hóa, tương tác ái lực và đặc tính hoạt động sinh học.
Bạn đang xem: Danh mục Danh mục
2. Mục đích:
Có 2 mục đích được sử dụng để tinh sạch protein là: Phân tích và Sản xuất lượng lớn.
· Phân tích: sản sinh một lượng nhỏ protein sử dụng trong các nghiên cứu khác nhau; và được sử dụng để phát hiện và xác định một protein trong hỗn hợp; hoặc hỗ trợ cho các mục đích phân tích như xác định, định lượng và nghiên cứu về cấu trúc, chức năng protein.
· Sản xuất lượng lớn: được dùng với mục đích tạo ra một lượng lớn protein phục vụ các mục đích khác ví dụ như sử dụng trong công nghiệp hoặc nghiên cứu sinh học cấu trúc. Thông thường người ta sử dụng phương pháp chuẩn bị hỗ trợ cho các ứng dụng phân tích. Quá trình chuẩn bị các sản phẩm thương mại như enzyme (lactase), protein dinh dưỡng (tách chiết từ protein đậu nành) và các sản phẩm thuốc sinh học đều ứng dụng phương pháp này.
3. Các bước tiến hành
– Tách chiết
· Phá vỡ tế bào hoặc mô bằng một trong các phương pháp sau: Liên tục lặp lại quá trình làm đông nhanh và rã đông nhanh (sonication), lọc hoặc thẩm thấu bằng các dung môi hữu cơ
· Cột sắc ký được dùng để thu các sản phẩm tinh chế
· Ly tâm để phân tách hoàn toàn protein ra khỏi hỗn hợp tế bào và ADN
· Enzym protease được sử dụng để giúp protein không bị phân hủy
– Phương pháp kết tủa và hòa tan khác
Xem thêm : Cách bảo quản cà rốt đảm bảo chất dinh dưỡng trong 6 tháng
Đối với các phân tử protein lớn, bước đầu tiên trong quá trình tinh chế phân lập protein thường là kết tủa với (NH4)2SO4 bằng cách tăng dần lượng (NH4)2SO4 và thu thập các mảng protein kết tủa riêng biệt. (NH4)2SO4 sau đó được loại bỏ bằng phương pháp thẩm tách. Ưu điểm của phương pháp này là rẻ tiền và sản xuất được một lượng lớn.
Những protein đầu tiên được tinh sạch là những protein hòa tan trong nước. Sự tinh chế protein xuyên màng đòi hỏi sự phá vỡ màng tế bào để phân tách protein màng ra khỏi các protein khác.
– Phương pháp siêu ly tâm
· Ly tâm là quá trình sử dụng lực ly tâm để phân tách các phần tử khác nhau trong hỗn hợp. Sau quá trình ly tâm thường thu được dung dịch không chứa các phân tử gọi là huyền phù và các hạt phần tử ở đáy ống ly tâm.
· Ly tâm theo gradien nồng độ đường sucrose (tiêu biểu thường sử dụng là đường sucrose, glycerol hoặc silica dựa trên mật độ gradien như Percoll) một chuỗi nồng độ gradien của đường được tạo ra trong ống ly tâm sau quá trình ly tâm, trong đó nồng độ cao nhất nằm ở đáy và thấp nhất nằm phía trên. Phân tử protein nằm ở lớp bề mặt của dung dịch ly tâm và quay ở vận tốc cao trong quá trình siêu ly tâm (Phương pháp siêu ly tâm là phương pháp ly tâm ở tốc độ cao).
4. Phương pháp tinh sạch protein
Sự lựa chọn phương pháp tinh sạch nào phụ thuộc vào nguyên liệu ban đầu, sự có mặt protein là cao hay thấp. Các nhà khoa học thường sử dụng công nghệ ADN kết hợp để kích thích tế bào sản sinh lượng lớn protein đích như các phân tử protein được đánh dấu His-tag để thuận tiện cho quá trình tinh sạch.
Phương pháp tinh sạch phân tích thường sử dụng 3 đặc tính để phân tách protein. Đầu tiên protein sẽ được tinh sạch dựa vào điểm đẳng điện bằng cách để chúng chạy qua gel có sự thay đổi pH hoặc cột thay đổi ion. Bước thứ 2, protein được phân tách dựa vào kích thước và khối lượng phân tử bằng cột sắc ký theo khối lượng phân tử hoặc SDS-PAGE. Protein sau đó tiếp tục được tinh sạch bằng 2D-PAGE và sau đó được phân tích để xác định nồng độ bằng phương pháp “dấu vân tay sinh khối sợi peptide”(peptide mass fingerprinting). Sau cùng, các protein sẽ được phân tách dựa trên tính phân cực và kỵ nước bằng phương pháp sắc ký lỏng hoặc sắc ký ngược pha.
Quy trình cơ bản trong phương pháp sắc ký là cho dung dịch có chứa protein chảy qua cột có kết dính với các nguyên liệu khác. Các prorein khác nhau sẽ tương tác khác nhau với nguyên liệu trên cột. Thông thường các protein sẽ được phát hiện khi chúng tách rời khỏi cột và được hấp thụ ở bước sóng 280nm.
· Phương pháp sắc ký dựa theo kích thước protein
Phương pháp sắc ký được sử dụng để phân tách protein trong dung dịch hoặc trong các điều kiện biến tính bằng cách sử dụng mạng lưới gel. Phân tử protein đích sẽ được thu ở cuối quá trình.
Nguồn ảnh: http://www.sciencebuddies.org/
· Phương pháp phân tách dựa trên sự phân cực và tính kỵ nước
Xem thêm : Những Cách Điều Trị Sâu Răng Hiệu Quả
– Phương pháp phân tách sắc ký dựa vào tương tác kỵ nước: HIC là môi trường lưỡng cực vừa có vùng kỵ nước và ưa nước, cho phép protein phân tách dựa trên bề mặt kỵ nước của chúng.
Nguồn ảnh: http://www.biologicscorp.com/
– Phương pháp phân tách sắc ký dựa vào sự trao đổi ion: các protein được phân tách dựa vào bản chất tự nhiên và liên kết phân cực của các phân tử ion trong phân tử protein.
Nguồn ảnh: http://www.biologicscorp.com/
– Phương pháp sắc ký ái lực là phương pháp dựa vào hình dáng cấu tạo của phân tử:
· Phương pháp gắn kết với phân tử kim loại: phương pháp này sử dụng trình tự 6 đến 8 phân tử histidine ở đầu -N hoặc đầu -C của phân tử protein. Chuỗi polyhistidine sẽ bám chặt vào phân tử ion kim loại hóa trị 2 như là niken và coban. Protein sẽ di chuyển qua cột có gắn cố định các phân tử ion niken, và những phân tử đánh dấu chuỗi polyhistidine sẽ được giữ lại. Sau đó loại bỏ chuỗi polyhistidine khỏi protein bằng dung dịch có chứa imidazole.
· Phương pháp sắc ký ái lực miễn dịch: sử dụng đặc tính bám dính chuyên biệt của kháng thể vào protein đích để thu các protein tinh sạch.
· Phương pháp tinh sạch protein được đánh dấu: phương pháp này còn được biết đến với tên gọi là kết tủa miễn dịch, một chuỗi peptide kháng nguyên sẽ được gắn kết vào protein và sau đó protein sẽ được tinh sạch qua cột hoặc ủ với kháng thể. Phương pháp này áp dụng để phát hiện sự tương tác đặc hiệu giữa các protein.
Nguồn ảnh: http://www.biologicscorp.com/
· HPLC (phương pháp sắc ký lỏng áp lực cao): là một dạng sắc ký áp dụng áp lực cao để đưa dung dịch qua cột nhanh hơn.
5. Phân tích
· Điện di trong điều kiện biến tính protein: dựa vào sự di chuyển của các ion phân cực trong vùng điện từ trên SDS-PAGE. Các protein sau đó sẽ được nhuộm với Coomassive blue hoặc bạc.
· Điện di trong điều kiện không biến tính protein: thường được sử dụng để phân tách metalloprotein có hoạt tính sinh học trong hỗn hợp protein trong QPNC_PAGE.
Phan Tién Dũng sưu tầm và dịch
Nguồn: https://ppe.edu.vn
Danh mục: Tips
